疫苗接種無疑是人類歷史上最引人注目的健康成就之一。在短短兩個多世紀(jì)的時間里，疫苗使我們實現(xiàn)了非凡的目標(biāo)，如徹底根除天花、消滅了世界大部分地區(qū)的脊髓灰質(zhì)炎，并使許多傳染病的死亡率和發(fā)病率大幅下降。
疫苗接種政策是公共衛(wèi)生的基石，人們非常重視確保接種安全有效的疫苗。疫苗的效力不僅取決于抗原成分，還取決于經(jīng)常使用的佐劑，以更有效的方式刺激免疫系統(tǒng)。佐劑是添加到疫苗中以改善對抗原免疫反應(yīng)的成分。此外，佐劑還有幾個好處，如可使每劑疫苗的抗原量和疫苗接種次數(shù)減少；在某些情況下，它們還增加了抗原成分的穩(wěn)定性，延長了其半衰期，并間接提高了其免疫原性。
抗原與佐劑相關(guān)，它們能夠通過激活先天免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)局部促炎反應(yīng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞募集到注射部位。抗原-佐劑復(fù)合物通過病原體相關(guān)分子模式（PAMP）來激活模式識別受體（PRR）途徑。這導(dǎo)致先天免疫細(xì)胞的激活，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子。
目前，歐洲藥品管理局和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的絕大多數(shù)人類使用的疫苗都使用鋁鹽作為佐劑，這是疫苗配方中使用最古老的佐劑。為了提高疫苗的安全性和有效性，增加新佐劑的種類和數(shù)量是非常必要的。納米技術(shù)和分子生物學(xué)等現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步有力地促進(jìn)了對佐劑成分的開發(fā)過程，從而提高了疫苗的效力。一種好的佐劑必須是安全的、有效的、易于生產(chǎn)的；具有良好的藥用特性（pH值、滲透壓、內(nèi)毒素水平等）和耐用性；最后，在經(jīng)濟上也可承受。微粒、乳液以及免疫刺激劑在疫苗生產(chǎn)中顯現(xiàn)出巨大的潛力。
佐劑可以根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，例如它們的物理化學(xué)性質(zhì)、來源和作用機制。最受關(guān)注的分類系統(tǒng)之一是基于其作用機制，將其分為兩大類:遞送系統(tǒng)佐劑和免疫增強佐劑。
鋁鹽
鋁鹽的佐劑特性是在20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)的，自1926年以來，這些化合物一直被用作疫苗佐劑。作為使用時間最長、疫苗中使用頻率最高的佐劑，目前獲得許可的疫苗中約有三分之一含有鋁佐劑。
在疫苗中，鋁以結(jié)晶氫氧化鋁（AlH）或無定形羥基磷酸鋁（AlP）的復(fù)合聚合物的形式存在，形成聚集的納米顆粒。AlH具有針狀納米顆粒的外觀，而在透射電子顯微鏡下觀察時，AlP呈現(xiàn)為網(wǎng)狀。這兩種鋁佐劑形式通常都溶解在檸檬酸鹽中，但AlP比AlH更可溶?？乖ㄟ^靜電相互作用和配體交換吸附在佐劑顆粒表面。鋁鹽/抗原結(jié)合增強抗原呈遞細(xì)胞（APC）的抗原攝取和呈遞。此外，鋁鹽刺激NLRP3炎癥小體的激活，導(dǎo)致IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，從而引起局部炎癥和APC的募集。
許多疫苗使用鋁佐劑，例如針對白喉和破傷風(fēng)、百日咳、乙型肝炎以及肺炎球菌和腦膜炎球菌的疫苗。在歐洲，《歐洲藥典》將疫苗中的鋁含量設(shè)定為每劑最多1.25 mg。在美國，《美國聯(lián)邦法規(guī)》將生物產(chǎn)品（包括疫苗）中的鋁含量設(shè)定為0.85mg/劑。與食品中主要以可溶性檸檬酸鹽或氯化物鹽形式存在的鋁不同，用作佐劑的無機鋁化合物的可溶性較差；這是它們輔助作用模式的一部分。因此，由于這種在生理pH下較差的溶解性，肌肉內(nèi)或皮下注射后疫苗中所含鋁的吸收率將非常緩慢。
一些研究評估了肌肉注射后鋁的動力學(xué)。一項實驗研究了基于肌內(nèi)注射用26Al標(biāo)記的AlH和AlP，鋁的總劑量為0.85 mg。結(jié)果顯示，在實驗的28天內(nèi)，AlH和AlP的吸收率分別為17%和51%。26Al的最大血清濃度（Cmax）為2μg/L。此外，鋁的神經(jīng)毒性已經(jīng)在體外、離體和動物模型和人類體內(nèi)進(jìn)行了研究。對細(xì)菌進(jìn)行的一些體外研究顯示沒有致突變性。而一些體內(nèi)研究結(jié)果往往不一致和互相矛盾，可能存在方法上的缺陷。因此，迄今為止，盡管鋁鹽或多或少地產(chǎn)生強烈的氧化應(yīng)激，但仍無法確定用作佐劑的鋁鹽（按推薦劑量）是否會產(chǎn)生毒性作用。
弗氏佐劑
弗氏佐劑包括完全和不完全的弗氏佐劑。這兩種佐劑都是油包水乳液，能夠攜帶抗原并刺激先天免疫系統(tǒng)。完全弗氏佐劑（CFA）在其結(jié)構(gòu)中包括熱殺死的分枝桿菌，其增強免疫反應(yīng)的刺激。然而，CFA能夠誘導(dǎo)強烈、持久的局部炎癥，這可能會帶來顯著的疼痛，并可能在注射部位出現(xiàn)潰瘍。不完全弗氏佐劑（IFA）不含分枝桿菌，在20世紀(jì)50年代被用作人類流感疫苗的佐劑；與沒有佐劑的相同疫苗相比，它可以誘導(dǎo)更強、持久的抗體反應(yīng)。
IFA的佐劑活性是基于其作為油性抗原沉積物的特征，抗原在注射部位從中連續(xù)釋放。這同時導(dǎo)致抗原半衰期的增加，以及通過吞噬作用、白細(xì)胞募集和浸潤以及細(xì)胞因子產(chǎn)生強烈的局部先天免疫刺激。然而，IFA在人類疫苗配方中的常規(guī)使用引發(fā)強烈的副作用。世界衛(wèi)生組織2005年進(jìn)行的一項調(diào)查顯示，約100萬IFA受試者的免疫接種有40000名接種者出現(xiàn)嚴(yán)重副作用（如無菌膿腫）。
MF59
MF59是一種油包水乳液，由角鯊烯、Span 85和Tween 80在pH 6.5的10mM檸檬酸鈉緩沖液中組成，平均粒徑約為165nm。這是1997年意大利批準(zhǔn)用于人類疫苗的第一種水包油乳液。目前，它被用于三價和四價（TIV和QIV）流感疫苗Fluad（Seqirus）中。研究表明，MF59的存在提高了流感疫苗在2歲以下兒童中的有效性。MF59也被用做HBV疫苗的佐劑，能夠引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)，比鋁誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更好。
關(guān)于作用機制，MF59具有與鋁鹽類似的效果。注射部位的貯庫活性可以忽略不計，研究表明其半衰期為42小時。相反，MF59具有誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的強大能力，包括產(chǎn)生高滴度的功能性抗體。MF59的存在刺激局部先天免疫細(xì)胞分泌趨化因子，如CCL4、CCL2、CCL5和CXCL8，進(jìn)而通過觸發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)來驅(qū)動白細(xì)胞募集、抗原攝取并遷移到淋巴結(jié)。MF59安全且耐受性良好的，在超過35個國家已接種數(shù)百萬劑。
AS03
AS03是一種水包油佐劑乳液，由表面活性劑聚山梨醇酯80和兩種可生物降解的油組成，即在磷酸鹽緩沖液中的角鯊烯和DL-α-生育酚。這種佐劑已用于流感疫苗，引發(fā)類似于MF59的免疫反應(yīng)，也用于瘧疾疫苗。歐盟于2009年批準(zhǔn)銷售AS03佐劑疫苗Pandemrix，而AS03佐劑甲型流感（H5N1）單價疫苗于2013年獲得FDA的批準(zhǔn)。
與MF59相比，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激特性似乎更強。此外，研究表明，AS03能夠通過激活NF-κB來刺激免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)肌肉和淋巴結(jié)中的細(xì)胞因子和趨化因子分泌，并促進(jìn)先天免疫細(xì)胞的遷移。AS03還可以刺激CD4+T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)，這可以導(dǎo)致持久的中和抗體產(chǎn)生和更高水平的記憶B細(xì)胞。AS02在AS03的基礎(chǔ)上進(jìn)一步補充了兩種強大的免疫刺激劑，QS-21（一種從黃芪中提取的皂苷）和3-O-去?；?4′-單磷酸脂質(zhì)a（MPL），以增強其免疫原性。
病毒樣顆粒
病毒樣顆粒（VLP）是由自組裝衣殼蛋白的外殼組成的二十面體或桿狀納米顆粒（?20–200 nm）；其已被長期研究用于疫苗開發(fā)。它們是非傳染性顆粒，不包括任何遺傳物質(zhì)。VLP是是由具有重復(fù)表位的外部病毒外殼形成的，這些表位會立即被免疫系統(tǒng)識別為非自身，從而產(chǎn)生強大的免疫反應(yīng)。除了這些重復(fù)的結(jié)構(gòu)基序外，VLP的大小與病毒相似（通常在20–800 nm之間），并經(jīng)過快速有效的處理，即使在沒有佐劑的情況下，也能產(chǎn)生快速持久的免疫反應(yīng)。
目前，有兩種重要的疫苗使用病毒樣顆粒佐劑誘導(dǎo)免疫：乙型肝炎和乳頭瘤病毒（HPV）疫苗。目前使用的乙型肝炎疫苗是一種含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重組DNA疫苗，其形式為VLP，用于預(yù)防乙型肝炎感染，該疫苗接種于15歲以下的嬰兒、兒童和青少年，或感染乙型肝炎的高危人群，在乙型肝炎攜帶者母親出生的新生兒中也顯示出良好的免疫原性（95-99%的有效性）。
HPV疫苗也是基于VLP平臺的疫苗。目前的九價HPV疫苗可預(yù)防九種不同的病毒基因型，這九種病毒基因型可導(dǎo)致90%的宮頸癌和80-95%的肛門生殖器癌。九價HPV疫苗含有九種不同基因型HPV（6、11、16、18、31、45、53、58）的L1蛋白，形成VLP，并通過重組DNA技術(shù)合成。
病毒體
病毒體是一種與天然病毒結(jié)構(gòu)非常相似的疫苗平臺。從結(jié)構(gòu)上講，它們是由缺乏病毒遺傳物質(zhì)的血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿）組成的重組流感病毒包膜形成的VLP。病毒體首次用于制造流感疫苗是在1975年，流感病毒是一種適用于所有年齡組的佐劑流感疫苗，對健康和免疫功能低下的兒童、成人和老年人都有良好的療效。它能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)并產(chǎn)生特異性抗體。病毒體保留了病毒HA的受體結(jié)合能力和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，它們在結(jié)合后無法在細(xì)胞中誘導(dǎo)感染。
病毒體是一個完美的遞送系統(tǒng)，能夠?qū)⒖乖D(zhuǎn)移到抗原呈遞細(xì)胞的胞質(zhì)中，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)。然而，由于其弱佐劑特性，病毒體在激活A(yù)PC和促進(jìn)交叉呈遞方面不是很有效。這種內(nèi)在的限制可以通過添加更強的佐劑來消除。如最近開發(fā)了一種基于病毒體的新型流感疫苗，該病毒體補充有Toll樣受體4（TLR4）配體單磷酰脂質(zhì)a（MPLA）和吸附到膜中的金屬離子螯合脂質(zhì)DOGS NTA-Ni。用了這些MPLA佐劑的病毒體對小鼠進(jìn)行體內(nèi)免疫可以誘導(dǎo)特異性CTL。
病毒體遞送系統(tǒng)佐劑的顯著優(yōu)點是它們能夠通過疏水性脂質(zhì)相互作用將抗原吸附到其表面和管腔上。將抗原吸附到病毒體的流體磷脂雙層表面會刺激與宿主細(xì)胞受體的相互作用。FDA已批準(zhǔn)病毒體作為人類使用的納米載體，它們具有非常高的耐受性和安全性。與亞單位疫苗對病毒入侵反應(yīng)不佳相反，病毒體能夠以與自然感染和其他強效佐劑非常相似的方式誘導(dǎo)強大的體液和細(xì)胞免疫。
迄今為止，除了上述兩種針對流感和甲型肝炎的基于病毒體的疫苗外，還有幾種基于病毒體疫苗正在研究中，包括針對艾滋病病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒和瘧疾的疫苗。
TLR1/2激動劑
在TLR1/2激動劑中，L-pampo是一種強效佐劑系統(tǒng)，由Pam3Csk4（Pam3）和聚肌苷酸：聚胞苷酸（polyI:C）組成。在一項研究中，L-pampo誘導(dǎo)了比鋁佐劑更強的抗HBV抗體的產(chǎn)生，還涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如增加的多功能CD4+T細(xì)胞。
此外，細(xì)菌脂蛋白是TLR2識別的最有效的配體。研究表明，源自細(xì)菌脂蛋白的合成脂肽是B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強激活劑，可用作疫苗佐劑。來自發(fā)酵支原體的巨噬細(xì)胞活化脂蛋白-2（MALP-2）顯示通過TLR2-和MyD88依賴性信號通路激活免疫細(xì)胞。除了MALP-2外，Pam2CSK4和Pam3CSK4也是公認(rèn)的TLR2激動劑，它們已被評估為對抗傳染性疾病如利什曼原蟲、瘧疾和流感的治療藥物。
TLR3激動劑
TLR3是一種檢測病毒dsRNA的內(nèi)涵體受體，它識別poly（I:C），因為它在結(jié)構(gòu)上模擬病毒RNA，從而誘導(dǎo)I型IFN和III型IFN的產(chǎn)生，并引發(fā)Th1細(xì)胞因子反應(yīng)。TLR3-poly（I:C）相互作用后產(chǎn)生的I型IFN對于傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞（cDC）有效激活CD8+T細(xì)胞反應(yīng)特別重要。此外，poly（I:C）產(chǎn)生的I型IFN刺激T細(xì)胞的克隆擴增，增加效應(yīng)T細(xì)胞比率和抗原特異性B細(xì)胞的數(shù)量。
poly（I:C）作為一種潛在的佐劑已被廣泛研究。然而，poly（I:C）對人體有毒性作用。因此，科學(xué)家的注意力集中在poly（I:C）的衍生物上，如poly（ICLC）和poly（IC12U），以及其他合成的TLR3激動劑，如ARNAX、IPH3102和RGC100。
迄今為止，一些研究已經(jīng)使用poly（ICLC）作為傳染病的候選疫苗，如惡性瘧原蟲和HIV，以及癌癥。研究表明，與LPS和CpG等其他TLR激動劑相比，poly（ICLC）能夠引發(fā)更強的Th1免疫反應(yīng)。一種新的具有佐劑潛力的TLR3激動劑是ARNAX，這是一種TLR3特異性配體，其毒性比poly（I:C）低。ARNAX研究的最重要的兩個領(lǐng)域是癌癥免疫療法和流感疫苗。
TLR4激動劑
作為疫苗佐劑研究的TLR4激動劑包括AS01、AS02和AS04，它們都含有內(nèi)體TLR4的配體MPLA。AS01已被用于開發(fā)針對瘧疾、艾滋病毒和結(jié)核病的疫苗。AS01是一種聯(lián)合佐劑系統(tǒng)，由兩種不同的免疫刺激分子MPLA和QS-21組成，包裹在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。這兩種化合物使用脂質(zhì)體作為載體，通過膽固醇依賴性內(nèi)吞作用到達(dá)細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，QS-21引起溶酶體不穩(wěn)定，并促進(jìn)蛋白激酶SYK的激活。MPLA作用于內(nèi)涵體TLR4，誘導(dǎo)TRIF依賴性信號通路。AS01激活胱天蛋白酶-1，從而促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活以及IL-1β和IL-18從APC的釋放。IL-18的釋放導(dǎo)致IFN-γ的快速產(chǎn)生，尤其是淋巴結(jié)中的自然殺傷細(xì)胞，從而促進(jìn)DC的成熟和Th1型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。
TLR5激動劑
TLR5是一種識別細(xì)菌鞭毛蛋白的受體，由幾種免疫細(xì)胞表達(dá)。與配體的連接導(dǎo)致炎癥途徑的激活和許多炎癥介質(zhì)的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮。此外，鞭毛蛋白能夠引起Th1和Th2反應(yīng)，而不像其他TLR配體，它們只能誘導(dǎo)Th1反應(yīng)。鞭毛蛋白通過激活NLRC4炎癥小體誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生和釋放。迄今為止，至少有三種使用鞭毛蛋白作為佐劑的疫苗處于臨床試驗階段：兩種針對流感病毒，一種針對鼠疫耶爾森菌。
TLR7/8激動劑
一些研究表明，TLR7/8的激動劑能夠強烈誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)。配體與TLR7/8結(jié)合能夠產(chǎn)生高水平的I型IFN、IL-12、TNF-α和IL-1β。此外，TLR7/8和TLR9激動劑是唯一能夠激活和促進(jìn)cDC和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）克隆擴增的激動劑分子，還能夠動員CD14+CD16+炎性單核細(xì)胞和CD14dimCD16+巡邏單核細(xì)胞。
最具代表性的TLR7/8激動劑是一些合成的小分子，如咪喹莫特（R837）和雷基莫特（R848），屬于咪唑喹啉類。咪喹莫特目前已被批準(zhǔn)用于治療生殖器疣、淺表基底細(xì)胞癌和光化性角化病，而雷喹莫特已被研究用于抗病毒和抗癌治療。
然而，這些小分子具有一些內(nèi)在的局限性。特別是，它們可以遠(yuǎn)離給藥部位擴散，從而遠(yuǎn)離抗原，導(dǎo)致療效降低并誘導(dǎo)全身副作用。已經(jīng)表明，這些分子與鋁佐劑的直接結(jié)合能夠提高疫苗的效力。此外，與合成聚合物支架、脂質(zhì)聚合物兩親物、聚乙二醇（PEG）、納米凝膠、明礬和各種其他合成聚合物的結(jié)合顯著增加了咪唑喹啉的遞送，并改善了DC和抗原特異性T細(xì)胞的成熟。此外，先前使用咪唑喹啉與一種或多種其他TLR激動劑（如MPLA和MPLA+CpG ODN）的研究表明，這種組合增加了先天免疫反應(yīng)，顯著產(chǎn)生了抗原特異性中和抗體，并改善了Th1反應(yīng)。所有這些創(chuàng)新都突出了TLR7/8激動劑作為候選佐劑的卓越潛力。
TLR9激動劑
TLR9自然識別由非甲基化胞嘧啶磷酸鳥嘌呤（CpG）二核苷酸代表的細(xì)菌DNA基序，通過MyD88依賴性途徑驅(qū)動先天免疫系統(tǒng)的激活。CpG-ODNs在NK細(xì)胞、B細(xì)胞和pDC中引起強大的趨化因子、細(xì)胞因子和抗體產(chǎn)生，從而驅(qū)動強烈的Th1型免疫反應(yīng)。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)出三類（A-C）不同類別的CpG-ODN，但只有B類的分子在臨床試驗中用作佐劑。B型CpG-ODN可以誘導(dǎo)pDCs的成熟，并直接與B細(xì)胞相互作用，以增強抗體的產(chǎn)生。
最近獲得許可的CpG 1018是一種具有高化學(xué)穩(wěn)定性，并能夠引發(fā)Th1型免疫反應(yīng)佐劑能力的寡核苷酸，被用作乙型肝炎疫苗Heplisav-B的佐劑。Heplisav-B中的CpG 1018提高了疫苗的效力，與需要三劑才能獲得最佳保護的傳統(tǒng)乙型肝炎疫苗相比，只需要兩劑疫苗。另一種CpG-ODN，CpG 7909，也在臨床評估中，并在HBV和瘧疾疫苗接種中顯示出令人鼓舞的結(jié)果。
此外，其他下一代TLR9激動劑也在開發(fā)中。MGN1703，是一種小的DNA分子，包括CG基序，但在結(jié)構(gòu)上與CPG-ODN不同。MGN1703由一段反向互補DNA組成，該DNA在中間是雙鏈的，兩頭的單鏈環(huán)包括三個非甲基化CG基序，形成啞鈴形結(jié)構(gòu)。MGN1703已被測試用作癌癥疫苗的佐劑，發(fā)現(xiàn)它能夠激活先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，僅產(chǎn)生輕微或暫時的副作用。
疫苗接種一直是且將繼續(xù)是人類抗擊傳染病的最有力武器之一。由于這些有效和安全的預(yù)防工具，人類得以從世界許多地區(qū)鏟除人類歷史上最可怕的敵人。最近的新冠肺炎大流行充分強調(diào)了疫苗接種的重要性，疫苗研究必須取得進(jìn)一步進(jìn)展，為未來可能得傳染病大流行做好準(zhǔn)備。疫苗的效力取決于佐劑的基本特性和作用。關(guān)于疫苗接種的未來，必須更多地關(guān)注這些分子，以生產(chǎn)出越來越安全有效的疫苗，造福人類。
